利用shRNA慢病毒高效敲降雄性小鼠睾丸基因

目的：建立快速、高效制备小鼠睾丸基因敲降的平台。方法：设计和构建靶向睾丸特异性表达基因Sox30转录本的 shRNA表达载体（pSliencer-GFP-shSox30）及其对照质粒（pSliencer-GFP-shScramble），与慢病毒颗粒包装后通过网微注射转导至出生24 d小鼠睾丸生精小管管腔，利用免疫荧光等检测慢病毒敲降鼠体内靶向基因的效率及敲降Sox30后对生殖细胞发育的影响。结果：慢病毒处理敲降后，相比对照组小鼠，shSox30病毒敲降组小鼠睾丸组织中Sox30蛋白表达水平显著下调，生精管腔中圆形精子发育阻滞在2~3步，Ⅶ~Ⅷ期生精管腔中无长型精子。结论：shRNA慢病毒有效降低小鼠睾丸靶基因的表达水平，在制备睾丸特定基因敲降动物模型中具有巨大优势。

Objective：The current study aims to establish an efficient and fast method for in vivo knockdown of endogenous genes in mouse testis. Methods：Lentiviral vector（pSliencer -GFP - shSox30）along with the control vector（pSliencer -GFP - shScramble）were designed and constructed. These lentiviral particles were microinjected into the mouse testis at postnatal day 24. Immunofluorescence and histological analysis was performed to evaluate the functional consequences in mouse testis upon Sox30 knockdown. Results：After the shSox30 lentiviral particles treatment，Sox30 protein was substantially decreased in mouse testis. Immunofluorescence of testis sections revealed that many spermatids were arrested at step 2-3. Histological examination of testis sections revealed that elongated spermatids were absent in seminiferous tubules at stage Ⅶ-Ⅷ. Conclusion：The shRNA-mediated lentivirus effectively decreases the expression level of target genes in mouse testis，providing a useful platform to knockdown endogenous genes in vivo.

RNA干扰 ； 动物模型 ； Sox30 ； 小鼠 ； 睾丸

RNAi ； animal model ； Sox30 ； mouse ； testis

小鼠的精子发生是一个高度复杂且有序的过程，涉及多个与精子发生相关的基因[1-3]。不同的精子发生相关基因在不同的时间窗内准确而有序地表达是精子发生成功的必要条件。为了更好地研究这些基因在精子发生过程中发挥何种功能，需要研究者建立相关基因的基因敲除动物模型。近年来，有研究者基于 RNA 干扰（RNA interference， RNAi）现象开发基因敲减平台，通过构建pSliencer⁃ GFP⁃shRNA 表达载体，并递送至小鼠睾丸内，成功敲降目的基因的表达[4]。

RNAi是指小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）诱发导致的同源mRNA高效特异性降解，从而引起基因表达沉默的现象[5]。siRNA结合至RNA 诱导的沉默复合物（RNA⁃induced silencing complex，RISC）[6-7]，再释放siRNA的随从链从而激活 RISC。激活后的RISC在siRNA的引导链的指导下降解其同源互补的mRNA，从而沉默特定基因的表达[8]。shRNA（short hairpin RNA）载体在细胞核内转录为pri⁃shRNA（primary shRNA），然后在双链RNA结合蛋白DGCR8 和 Drosha 蛋白的加工下形成 pre ⁃ shRNA（precursor shRNA）[9]。pre⁃shRNA 在 Exportin⁃5 等蛋白因子的协助下从细胞核转运至细胞质[10]。细胞质中的 pre⁃shRNA在Dicer酶等蛋白因子加工下去除其茎环结构成为siRNA，从而启动RNAi过程来沉默目的基因表达[11]。基于这一原理，有研究者设计靶向特定序列的shRNA敲降载体，从而诱导RNA特异性降解[12]。

传统的基因敲除动物模型一般使用CRISPR/Cas9等基因编辑技术进行遗传学模型的构建[13]。即使 CRISPR/Cas9 技术经过多年发展已经趋于成熟，但仍存在耗时较长、费用较高、不能在特定时间点敲除目的基因，以及脱靶效应等诸多问题[14]。同时，某些基因的敲除小鼠模型存在胚胎死亡现象，常导致实验人员无法得到敲除小鼠。为了规避这些问题，需要研究者开发一个快速、特异、安全的睾丸原位基因敲减平台。近些年来，很多研究通过向睾丸递送 siRNA[15]或反义寡核苷酸（antisense oli⁃ gonucleotides，ASO）[16]来完成睾丸特定基因的敲减。虽然向小鼠睾丸递送 siRNA 和 ASO 可以规避 CRISPR/Cas9等基因技术存在的问题，但也存在着作用时间维持较短的问题[17]。shRNA敲降载体具有表达shRNA的元件，可以通过慢病毒整合到基因组上稳定表达。研究者可以向小鼠睾丸递送shRNA慢病毒敲降载体基因来维持稳定、长效的基因表达沉默。本研究通过构建靶向Sox30基因的shRNA慢病毒敲降载体，通过网微注射进入出生24 d小鼠睾丸来敲降 Sox30基因转录本，观察Sox30蛋白是否可被持续敲降，及生精管腔中生殖细胞是否有发育异常现象。

实验所使用的小鼠均为 24日龄C57BL/6J（SPF级）雄性小鼠（南京医科大学实验动物中心），本研究经南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准。Oligo（上海生工公司）；限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ、XbaⅠ、XhoⅠ、CutSmart Buffer、10×NEB Buf⁃ fer3.1（NEB 公司，美国）；FastPure Gel DNA Extrac⁃ tion Mini Kit（南京 Vazyme 公司）；EndoFree Mini Plasmid Kit Ⅱ（TIANGEN公司，美国）；胰酶、胎牛血清、DMEM（Gibco公司，美国）；琼脂糖（上海生工公司），TRIzol（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；RT reagent Kit（TaKaRa 公司，日本）；DAPI（Sigma 公司，美国）；花生凝集素（peanut agglutinin，PNA） （Vector Labs公司，美国），EGFP抗体、Sox30抗体、二抗（Abclonal公司，美国）。

将公司合成的shSox30⁃oligo1和shSox30⁃oligo2 用高压灭菌后的ddH2O溶解。按照4 μL oligo1、4 μL oligo2、2μL 10×NEB buffer2、10μL ddH2O配置退火体系。95℃水浴退火5 min，自然冷却至室温，4℃保存。

空载环状的 pSilencer 载体按照 2 μg pSilencer 载体、1 μL XbaⅠ内切酶、1μL XhoⅠ内切酶、5 μL CutSmart Buffer，再加 ddH2O 补齐至 50 μL 体系，37℃水浴 3 h。将酶切后的产物在 1%琼脂糖凝胶中电泳30 min，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的产物。空载的pSuper载体分两步进行酶切，先按照 2 μg pSuper载体、1 μL BglⅡ内切酶、5 μL 10×NEB Buffer 3.1，加 ddH2O 补齐至 50 μL 体系，37℃水浴 3 h。线性产物使用试剂盒纯化后，再按照 2 μg pSuper线性载体、1 μL HindⅢ内切酶、5μL 10×NEB Buffer2.1，加 ddH2O 补齐至 50μL 体系，37℃水浴 3 h。1%琼脂糖凝胶中电泳30 min，使用DNA凝胶回收试剂盒纯化产物得到双酶切的线性pSuper产物。同样地，pSuper⁃shSox30按照pSuper酶切体系酶切。

20 ng线性pSuper载体、1 μL 10×T4 Buffer、1 μLT4 DNALigase、再加双链 Oligos 补足至 10 μL 体系， 16℃过夜连接。连接产物转化，涂氨苄抗性平板，挑单克隆菌落，经菌落PCR后初步选取阳性菌落送测序验证。测序验证成功连接的pSuper⁃shSox30，酶切（同1.2.2）回收小片段，与线性pSilencer按照 20 ng pSilencer、20 ng pSupersh⁃shSox30 小片段、1 μL 10× T4 Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、ddH2O 补至 10 μL，16℃过夜连接。连接产物转化，挑取单克隆菌落测序验证。

表1 shSox30核苷酸序列

Table1 The oligonucleotide sequences of shSox30

293T 细胞用含 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素的 DMEM 培养基于 37℃、5% CO2的恒温培养箱常规培养，每1~2 d换液1次，当细胞密度达 70%~80%时转染。按照 2.5 μg 质粒、 50 μL 0.5 mmol/L CaCl2、100 μL 2×HBS，加水补齐至 200 μL配置转染试剂。转染后36~48 h收样。空白组为未转染质粒组，过表达组为单转 Sox30 过表达质粒 PRK5⁃HA⁃Sox30，对照组为 Sox30 过表达质粒 PRK5⁃ HA ⁃ Sox30 与 shScramble 共转染，实验组为 Sox30过表达质粒PRK5⁃HA⁃Sox30分别与shSox30⁃1、 shSox30⁃2共转染。

细胞加入TRIzol试剂，冰上研磨至组织充分裂解， 12 000 r/min 4℃离心 30 min，取上清并加入 200 μL 氯仿，剧烈摇晃后室温静置 3 min，12 000 r/min 4℃ 离心 30 min，取上清并加入等体积的异丙醇，静置 10 min 后 12 000 r/min 4℃离心 15 min，75%乙醇清洗沉淀后加入适量 DEPC水溶解 RNA。通过紫外可见分光光度计检测 RNA浓度和纯度；采用TaKaRa的 PrimeScript RT reagent Kit逆转录试剂盒合成 cDNA， qPCR反应程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s。

病毒上清溶液在4℃、50 000 g转速下离心90 min 以获得高滴度的慢病毒。再使用高滴度的慢病毒包装 pSilencer⁃GFP⁃shSox30 敲降载体形成慢病毒敲降载体。慢病毒敲降载体与台盼蓝染液混合后使用毛细管注射进入出生 24 d 的小鼠睾丸生精小管。

TBS清洗组织切片后用 1%TBST配制的含 10% 鸡血清的封闭液室温封闭 1 h，一抗稀释液（EGPF 抗体1∶500）4℃过夜孵育，加入二抗稀释液（PNA+ 绿色荧光二抗1∶100）37℃孵育 1 h，TBS清洗 3次后滴加DAPI封片，荧光显微镜拍片保存。

实验数据结果采用GraphPad Prism7软件分析，符合正态分布的定量数据结果以均数±标准差（x- ± s）表示。两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 Dunnett⁃t 检验，P